DNA dizilimi Maxam-Gilbert, Sanger yöntemi, örnekler

DNA dizilimi (deoksiribonükleik asit), ilgili genetik materyalde nükleotitlerin sırasının bilinmesini sağlayan moleküler biyoloji laboratuvarlarında gerçekleştirilen bir prosedürdür. Ek olarak, RNA (ribonükleik asit) dizilimi de açığa çıkarılabilir..

Bu teknik biyolojik bilimlerin gelişimi için vazgeçilmez olmuştur. Örneğin tıbbi teşhis ve adli araştırmalar gibi diğer bilgi alanlarına da uygulanabilir..

Önceden, bir DNA zincirinin dizilişinin oligonükleotidlerde sadece birkaç baz çiftinin tanımlanmasına izin veren yavaş ve pahalı bir aktivite olduğu düşünülüyordu..

Günümüzde, bilimin tüm ilerlemelerinde, DNA sıralaması, bu alandaki yaklaşık 50 yıllık araştırmanın katkısı sayesinde dünya çapında birçok laboratuvarda rutin bir işlemdir. Zincir uzunluğuna gelince, çok kısa sürede milyonlarca baz çiftine kadar sıralama yapabilirsiniz..

Bunu yapmak için, fiyat ve doğruluğa göre değişen düzinelerce teknik geliştirildi. Bu yazıda, klasik ve modern teknikleri, her biri avantaj ve dezavantajları olan.

Şimdiye kadar, sıralama teknikleri küçük prokaryotlardan ve mayalardan insan genomuna kadar tam genom dizisinin elde edilmesine izin verir.

indeks

• 1 DNA yapısı
• 2 Tarihçesi
• 3 Sanger yöntemi
  • 3.1 Reaksiyonun ana bileşenleri
  • 3.2 Sonuçların okunması
• 4 Otomatik sıralama
• 5 Maxam-Gilbert dizilimi
  • 5.1 Prosedür
  • 5.2 Sonuçların okunması
• 6 Büyük sıralama
  • 6.1 Pyrosequencing
  • 6.2 Sentez yoluyla sıralama
  • 6.3 Ligasyon ile sıralama
  • 6.4 Sıralama İyonu Torrent
• 7 Örnekler
  • 7.1 İnsan genomunun dizilimi
• 8 Önemi ve uygulamaları
• 9 Kaynaklar

DNA'nın yapısı

DNA dizilimi için kullanılan yöntem ve teknikleri anlamak için molekül yapısının ve bileşiminin belli başlı yönlerini bilmek gereklidir..

DNA, bakterilerden büyük su hayvanlarına kadar tüm canlılarda bulunan bir biyomoleküldür. Organeliler - mitokondri ve kloroplastlar gibi - içlerinde dairesel bir DNA molekülüne sahiptir. Bazı virüslerde bile bulunan genetik materyal DNA'dır..

Yapısal olarak, DNA bir nükleotid kümesidir. Her biri bir karbonhidrat, azotlu bir baz (A, T, C veya G) ve bir fosfat grubu ile entegre edilir. DNA diziliminin amacı, dört azotlu bazın dizilimde bulunduğu sırayı ortaya koymaktır..

tarih

1950'lerin ortalarında araştırmacılar Watson ve Crick, Christolojik teknikleri kullanarak DNA'nın yapısını tanımladılar. Bununla birlikte, bu araştırmacıların hiçbiri diziyi ortaya çıkarmanın bir yolunu bulamamıştır..

Bazı öncekiler olmasına rağmen, en önemli olay 1977'de Sanger'in yönteminin yaratılmasıydı. Yöntemin babası Frederick Sanger, biyolojik bilimlere yaptığı büyük katkılarından dolayı iki Nobel ödülü kazanan bir İngiliz biyokimyacıydı..

Bu teknik, literatürde "zincir sonlandırma" veya dideoksinükleotitler olarak da bilinir. Daha sonra, bu tekniğin prensiplerini ve bunun iyileştirilmesi ve inovasyonuna dayalı olarak geliştirilenleri tanımlayacağız..

Sanger yöntemi

Sanger'in yönteminin geliştirilmesi, moleküler biyolojide çok önemli bir olayı temsil ediyordu. Normalde hücrede meydana gelen DNA çoğaltma işleminin temel bileşenlerini içerir, ancak özel bir bileşen ekleyerek: dideoksinükleotitler.

Reaksiyonun ana bileşenleri

- DNA polimeraz: enzim DNA polimeraz, sürecin önemli bir unsurudur. Bu molekül, DNA zincirinin replikasyonuna katılır ve rolü, deoksiribonükleotitler trifosfat ile tamamlayıcı olanlarla eşleşen yeni zincirin sentezidir..

DNA'da timinlerin (T), adenlerle (A) iki hidrojen bağıyla eşleştirildiğini, sitosinin (C) guaninle (G) üç köprü oluşturduğunu unutmayın..

- Nükleotidler: Sanger dizilimi iki tür nükleotid içerir, dört 2'-deoksinükleotit (dATP, dGTP, dCTP ve dTTP olarak kısaltılır) ve dört dideoksinükleotit (ddATP, ddGTP, ddCTP ve ddTTP)..

Her ne kadar dideoksinükleotitler, normalde DNA'ya dahil edilen monomerlere benzese de, yapılarında bir -OH grubu yoktur. Bu, zincire yeni bir nükleotit eklenmesini imkansız kılar..

Bu nedenle, özel bir nükleotid oluşum halindeki zincire tamamen rasgele bir şekilde eklendiğinde sentez felç olur. Bu şekilde, reaksiyonun sonunda, her biri reaksiyonun farklı bir noktada durduğu, farklı boyutlarda zincirler vardır..

Deneysel olarak dört deneme hazırlanır. Her biri, ilgilenilen biyolojik numuneden ekstrakte edilen DNA, normal nükleotitler ve dört özel nükleotit tipinden birini içerir. Veya özel nükleotidler, bir tür floresan işaretleyici ile işaretlenir (aşağıya otomatik dizileme bakınız).

Sonuçların okunması

İlk adım, sentezlenen zincirlerin her birini boyutlarına göre ayırmaktır. Özel üslerin nereye yerleştirildiğine bağlı olarak, bazıları diğerlerinden daha uzun olacaktır.

Bir ayırıcı özellik olarak ebadı kullanarak karışımın bileşenlerinin ayrılmasına izin veren farklı biyokimyasal teknikler vardır. Sanger yönteminde, farklı zincirler elektroforez ile ayrılır. Tekniğin en gelişmiş varyantlarında kılcal elektroforezi kullanılır.

Böylece, daha uzun teller kısa değişkenlerden daha az hareket eder. Ardından, bu sistem her dideoksinükleotide dahil olan markörü tanıyan bir okuyucudan geçer. Bu şekilde, sekansın sırası bilinebilir.

Bu "ilk nesil" teknik, 1 kilobazdan büyük olmayan DNA parçalarını okuyabilir. Şu anda, Sanger'in metodu, genellikle modern modellerinde birçok laboratuvarda kullanılmaktadır. Ek olarak, en karmaşık tekniklerle elde edilen sonuçları doğrulamak için kullanılır - ancak daha az kesin.

Otomatik sıralama

Büyük ölçekli sıralama gerektiğinde, işlem otomasyonla hızlandırılır. Bu, bunları ayırmak için primerlerin floresan ürünler ile işaretlendiği Sanger zincir sonlandırma yönteminin bir çeşididir..

Daha sonra, reaksiyonun ürünü bir elektroforez içinde gerçekleştirilir - hepsi tek bir şeritte. Her bir parça jelin son kısmını terk ettiğinde,% 1'i çevreleyen bir hata ile floresan etiketi ile hızlı bir şekilde tanımlanır..

En karmaşık sistemler, bir robota bağlı bir bilgisayar tarafından işletilen 96 kılcal boru sistemine sahiptir. Yani, 96 DNA örneği aynı anda değerlendirilebilir. Böylece elektroforezi içeren süreç ve sonuçların analizi tamamen otomatikleştirilmiştir..

Bir günde, bu sistemler 550.000'e kadar üs sıralayabilir. İşlem sırasında, insan işi gerekli değildir, metoda başlamak sadece 15 dakika sürer..

Maxam-Gilbert'in sıralaması

Sanger çalışmalarını yayınladığı sırada, Allan Maxan ve Walter Gilbert adlı iki araştırmacı, DNA sekansını elde etmek için başka bir yöntem geliştirmeyi başardı. Yöntem o zaman popülerlik kazandı, ancak daha sonra Sanger'in yönteminin iyileştirilmesiyle yerinden edildi.

Sanger'in metodunun aksine, Maxan ve Gilbert'in sıralanması (veya aynı zamanda bilindiği üzere kimyasal sıralamanın) hibridizasyon reaksiyonları içermez. Metodoloji bir uçta reaktif ajanlarla işaretleme ve ardından bir saflaştırma işleminden oluşur.

Bu tekniğin olumsuz yönlerinden biri muazzam karmaşıklığı ve kullanıcı için tehlikeli kimyasalların kullanımında yatmaktadır. Kimyasal arızalar, DMS, formik asit, hidrazin ve hidrazinin tuzlarla uygulanmasıyla indüklenir.

süreç

Protokol, telin 5 'ucundaki fosfor işaretleyici 32 ile etiketleme ile başlar, daha sonra azotlu bazın kimyasal bir modifikasyonu meydana gelir ve ayrılır. Sonunda abasik bölgenin ayrılması meydana gelir.

İlk olarak sıralanacak zincir daha küçük parçalara kısaltılır. Bu adım, olağanüstü aşırılıklara neden olan kısıtlama enzimleriyle gerçekleştirilir.

Daha sonra reaksiyon, amacı fosfat grubunu ortadan kaldırmak olan bir alkalin fosfataz ile gerçekleştirilir. Dolayısıyla, etiketlemeyi gerçekleştirmek için bir polinükleotid kinaz kullanılabilir.

Zincir denatüre edilmiştir (iki iplik açık). Sonra kimyasalları uygulamaya devam ediyoruz. Bu bölünme reaksiyonları kontrollü bir şekilde yapılır ve uygulanan her kimyasal tarafından hangi tür bağlar kırılır.

Sonuçların okunması

Sanger yönteminde olduğu gibi sonuçların okunması bir elektroforez sisteminde elde edilen zincirlerin büyüklüğüne göre ayrılmasını içerir. Poliakrilamitten oluşan sistemler jelin okunması için çok yeterli bir çözünürlük elde edilmesini sağlar.

Büyük sıralama

Büyük dizileme, İngilizceden NGS olarak kısaltılmış bir dizi yeni yöntemi kapsıyor. "Gelecek Nesil Sıralama ".

NGS olarak kataloglanan yöntemler önceki bir DNA amplifikasyon aşamasını gerektirir (tek bir molekülle çalışmazlar). Ek olarak, kullanılan platformlar büyük ölçüde değişmektedir. En popüler yöntemlerin ilkeleri aşağıda açıklanacaktır:

pirosekanslanmadır

DNA zincirine her yeni bir nükleotit eklendiğinde ortaya çıkan bir pirofosfat salınımının izlenmesini içerir. Bir enzim sistemi birleştiğinde, her seferinde yeni bir nükleotit eklendiğinde ışık yayılımı (bir kamera tarafından saptanabilen) gerçekleşir.

İşlem, ışık emisyonu olup olmadığını doğrulamak için her azot bazının ayrı inkübasyonu ile başlar. Pyrosequencing uzun iplikçiklerin okunmasını yapabilir, ancak bulunan hata oranı yüksektir..

Sentezle sıralama

Bu, etiketli nükleotidlerin dahil edilmesini içerir. Bu flüoresan bileşenleri eklenir, yıkanır ve dahil edilen nükleotit not edilir. Daha sonra, nükleotid etiketlemesi elimine edilir ve telin sentezi devam edebilir. Bir sonraki adımda, etiketli bir nükleotit de dahil edilecek ve söz konusu adımlar tekrarlanacaktır..

Bu tekniğin bir dezavantajı, floresan markerler tamamen ortadan kalkmadığında ortaya çıkar. Bu emisyonlar, önemli hatalara neden olan arka plan hataları oluşturur.

Ligasyon ile sıralama

DNA polimeraz kullanmadığından bu teknik diğerlerinden farklıdır. Bunun yerine, bu metodoloji için anahtar enzim ligazdır. İşte floresan etiketli DNA parçaları kullanılmış, enzim tarafından bağlanmış ve tespit edilmiş.

Bu teknikle ilgili en büyük sorun, işlenebilen çok kısa parça uzunluğu..

İyon Sıralama Torrent

Bu teknik H iyonunun ölçümüne dayanmaktadır⁺ her seferinde yeni bir nükleotid dahil edilir. Prensip pyrosequencing benzer, ancak çok daha ucuz.

Örnekler

İnsan genomunun dizilimi

İnsan genomunun dizilimi, biyoloji alanındaki en umut verici zorluklardan biri olmasının yanı sıra, bilim tarihindeki en beğenilen rakiplerden biri olmuştur. Aslında, projeye katılan bilim adamları için, genomun sıralanması bir rekabet haline geldi.

1990'da, Nobel Ödülü'nü kazanan James Watson'ın ünlü bilim adamı tarafından yönetilen “insan genom projesi” ne başladı. Bir yıl sonra, 1991'de Venter, Watson'ı “döverek” ve genomu kendisinden önce dizme görevini üstlendi. Ancak, 1992 yılında, Watson emekli oldu ve emir başka bir araştırmacı tarafından alındı..

1995 yılında Venter, bir bakteriyel genomun dizilimini, dizilimini rasgele dizilim yöntemiyle gerçekleştirdiğini açıkladı. Benzer şekilde, karşı takım bir yıl sonra maya genomunun dizilimini açıkladı.

2000 yılında yarış sona erdi. Her iki şirket de genomun ilk sonuçlarını bilimdeki en prestijli dergilerden ikisinde yayınladı: doğa ve bilim.

Ancak, bilim adamları önerileri geliştirmek için çalışmaya devam etti ve 2006'da bazı insan kromozomları dizileri tamamlandı..

Önem ve uygulamalar

Bir molekülün nükleotitlerinin sırasının DNA kadar önemli olduğunu bilmek, biyologlar ve ilgili profesyoneller için değerlidir. Bu polinükleotidler zinciri, tüm yaşam formlarının geliştirilmesi ve sürdürülmesi için gerekli tüm bilgileri içerir..

Bu nedenlerden dolayı, bu sekansın bilgisi biyolojik araştırma için önemlidir. Temel olarak, sıralama, biyolojik sistemlerin en önemli özelliklerinden birini ölçmemizi ve aralarında farklar oluşturmamızı sağlar..

Sıralama, taksonomistler ve sistematistler tarafından yaygın olarak kullanılır, çünkü bazı DNA dizileri, iki organizmanın aynı türe ait olup olmadığının yanı sıra aralarındaki filogenetik ilişkiler hakkında hipotezler önerebilme sonucunu belirleme kriterleri belirlemeye izin verir..

Ek olarak, DNA dizilimi tıp ve teşhis alanında da uygulamalara sahiptir. Örneğin, sıralama yoluyla basit nükleotid polimorfizmleri (SNP) olarak adlandırılan bazı hastalıkları (kanser gibi) geliştirme eğilimini değerlendirmemizi sağlayan ekonomik ve erişilebilir sistemler bulunmaktadır..

Kriminalistik ve adli tip soruşturmaları da sıralama teknikleriyle zenginleştirilmiştir ve belirli bir bireyin bir suça katılmasının güvenilir bir kanıtı olarak kullanılabilir..

referanslar

1. Heather, J.M., & Chain, B. (2016). Sıralayıcıların dizisi: DNA sıralama dizisinin tarihi. Genomik, 107(1), 1-8.
2. Koboldt, D.C., Steinberg, K.M., Larson, D.E., Wilson, R.K., ve Mardis, E.R. (2013). Yeni nesil dizilim devrimi ve genomik üzerindeki etkisi. hücre, 155(1), 27-38.
3. Levy, J. (2010). Bilimsel rekabetler. Galileo'dan insan genom projesine. Paraninfo Editörlüğü.
4. Sanger, F., Nicklen, S., & Coulson, A.R. (1977). Zincir sonlandırıcı inhibitörlerle DNA dizilimi. Ulusal bilimler akademisinin bildirileri, 74(12), 5463-5467.
5. Schuster, S.C. (2007). Yeni nesil sıralama günümüz biyolojisini dönüştürüyor. Doğa yöntemleri, 5(1), 16.
6. Xu, J. (Ed.). (2014). Yeni Nesil Sıralama. Caister Academic Press.