Proteinaz K özellikleri, enzimatik aktivite ve uygulamalar



proteinaz K serin proteazlar grubuna ait bir enzimdir, yani aktif katalitik merkezinde bir amino asit serindir ve peptid bağlarını hidrolizle parçalama işlevine sahiptir. Buna karşılık bu enzim, subtilisinler protein ailesine aittir (peptidaz S8).

Proteinaz K'nın molekül ağırlığı (MW) 28.900 daltondur ve ilk kez 1974'te mantar özlerinden izole edildi. Engyodontium albümü, daha önce adıyla bilinen Tritirachium albümü Limber.

Saçtaki keratini bozabileceğini gösteren yüksek bir proteolitik kapasite sunar. İngilizce'deki keratin kelimesi "keratin" olarak yazılmıştır, dolayısıyla "proteinaz K" olarak adlandırılmıştır..

Doğal proteinleri parçalama kapasitesinin yüksek olması nedeniyle, bu enzim çeşitli moleküler biyoloji tekniklerinde kullanışlıdır. Esas olarak, yüksek moleküler ağırlıklı (MW) olan nükleik asitleri izole etmek ve hazırlamak için kullanılır.

Proteinaz K, proteinleri tahrip ederken RNaz ve DNazları etkisiz hale getirirken nükleer DNA'yı serbest bırakarak etki eder, yani DNA ve RNA preparatlarındaki nükleazları ortadan kaldırır..

Öte yandan, proteinaz K'nın prion proteinlerinin (PrPC) çalışmasında kullanımı için araştırmacıların ilgisini çeken bazı denatüre doğal proteinleri hidrolize edebileceği görülmüştür..

Bununla birlikte, yüksek proteolitik potansiyeline rağmen, proteinaz K'nın etkisine dirençli proteinler vardır. Bunlar arasında, bulaşıcı süngerimsi ensefalopati ile ilişkili prionlar (PrPSc) olarak adlandırılan bazı anormal proteinler vardır..

indeks

  • 1 Proteinaz K'nın özellikleri
  • 2 Enzimatik aktivite
  • 3 Uygulamalar
  • 4 Proteinaz K'nın Avantajları
  • 5 Proteinaza dayanıklı proteinler K
  • 6 Kaynakça

Proteinaz K'nın özellikleri

Proteinaz K, üç kattan oluşan üçüncül bir yapıya sahiptir ve iki sarmal katının arasına serpiştirilmiş yedi zincirli β yaprağa sahiptir. S8 peptidazlar ailesine ait olduğu için, aktif bölgesinde, sıralı sırasını (Asp, His ve Ser), yani diğer peptidaz familyasından ayıran katalitik bir triad ile karakterize edilir..

Serin proteaz grubundan bu enzim, alifatik ve aromatik amino asitlerin karboksilik grubuna yakın peptit bağlarının hidrolize edilmesi ile karakterize edilir..

Öte yandan, proteinlerin denatürasyonuna yardımcı olmak için kullanılan ve doğal yapılarını yitirmelerine yardımcı olmak için kullanılan sodyum dodesil sülfat (SDS), Tris-HCL ve EDTA gibi bazı aşındırıcı maddelerin varlığında etkili olabilir..

Bu, elektroforez tekniği için proteinlerin hazırlanmasında ön bir adımdır. Proteinaz K'nin etki gösterdiği pH aralığı oldukça geniştir (2.0 ila 12.0), pH 7.5 ila 12.0 arasındadır ve izoelektrik noktası 8.9'dur. Gözlenebileceği gibi, çok geniş bir pH aralığına karşı aktiftir.

K proteinazında öne çıkan bir diğer karakteristik, yüksek sıcaklıklardaki (50 - 60 ° C) varlığındaki kararlılığıdır..

Enzimatik aktivite

Proteinaz K, kalsiyum iyonu varlığına ihtiyaç duyar, ancak stabilitesini korumak için gerekliyse, bunun aktivitesini etkilemez.

Proteinaz K'nın substratın tamamen sindirimini gerçekleştirmesi için yaklaşık 5 dakika ila 2 saat arasında yaklaşık bir temas süresi gereklidir..

Bununla birlikte, bu anlamda Daza ve diğerleri, K proteinazına birkaç kez maruz kaldıklarında elde edilen DNA'nın saflığını karşılaştırmış ve uzun süreli inkübasyonun (24 saate kadar) DNA kalitesini önemli ölçüde artırdığı sonucuna varmıştır..

Şimdi, farklı protokollerde proteinaz K enziminin kullanılan konsantrasyon ile ilgili olarak, çok çeşitli olduğu söylenebilir..

Çok düşük konsantrasyonlardan (5 μg / ml) 500 μg / ml konsantrasyonlarına kadar kullanılabilir. Ancak en sık yapılan iş konsantrasyonları, özellikle protein sindirimi ve nükleaz inaktivasyonu için, 50-100μg / ml arasında değişmektedir. Her ne kadar doku tedavisi için 2 mg / ml konsantrasyon gerekli olsa da.

uygulamaları

Uygulamaları çok geniştir ve aşağıda özetlenebilir:

-Tuzlama, PK-SDS, setil-trimetil amonyum bromür (CTAB), modifiye potasyum asetat ve sodyum iyodür ile ekstraksiyon gibi protein sindiriminde ve DNA ekstraksiyonunda kullanılır..

-Çekirdeklerin etkisizleştirilmesi (RNazlar ve DNazlar).

-Hibridizasyon tekniğinde yerinde (HIS), istenmeyen proteinleri yok etmenin yanı sıra nükleik asidin salınmasına yardımcı olmak için.

-Protein modifikasyonu.

-Araştırma düzeyinde, çeşitli çalışmalarda.

K proteinazının avantajları

Proteinaz K kullanan DNA ekstraksiyon teknikleri arasında, bazıları onu kullanmayan diğerleri ile karşılaştırmalı birkaç araştırma yapılmıştır ve bunların tümü, enzimi kullanırken daha büyük faydalar olduğu sonucuna varmıştır. Avantajlar arasında aşağıdakilerden bahsedilebilir:

-Yüksek kalitede ve saflıkta yüksek molekül ağırlıklı DNA elde edilir.

-Ekstre edilen DNA 3 aya kadar stabil.

Ekstre edilen DNA aşağıdaki tekniklerde kullanılabilir: Southern blot, polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), elektroforez, diğerleri arasında.

Proteinaz K'ya dayanıklı proteinler

Çeşitli araştırmalar, prionların (anormal PrPSc toksik proteinleri), PrPC proteinlerinden (doğal) ayrıldığı, proteinaz K'nın etkisine dirençli oldukları için PrPC proteinlerinden (doğal) ayrıldığı sonucuna varmıştır..

Diğer yazarlar, PrPSc'nin yapısında, hassas kısımların ve proteinaz K'ya dirençli başkalarının olduğunu tarif etmişlerdir. Bununla birlikte, her iki kısım da eşit derecede toksik ve enfektiftir..

Öte yandan, 1987’de Bastian ve ortak çalışanlar 4, 28, 30, 66 ve 76 kda protein türünden izole ettiler. Spiroplasma mirum. Hepsi proteinaz K'nın etkisine dirençliydi ve ayrıca bazı prionlarla çapraz reaksiyona girdi..

Bu türün katarakta ve önemli nörolojik hasara neden olabileceği ve Bastian'ın bilimsel bulguları nedeniyle, diğer araştırmaların yanı sıra, bu mikroorganizmayı bulaşıcı süngerimsi ensefalopati ile ilişkilendirmek için bir girişimde bulunulduğu bilinmektedir..

Bununla birlikte, bu dejeneratif nörolojik patolojinin etiyolojisi, günümüzde hala prionlara bağlanmaktadır..

Bu anlamda, Butler ve 1991'deki ortak çalışanlar, iki suşundan 40 Kda proteinaz dirençli bir protein K sınıfını tanımlamış ve karakterize etmiştir. Mycoplasma hyorhinis. Bu patojen, domuzları etkiler, dokularını enfekte eder, ancak bu durumda test edilen prionlarla çapraz reaksiyon yoktu..

Bu konuda pek çok bilinmeyeni aydınlatmak için daha fazla araştırmaya ihtiyaç var.

referanslar

  1. Bastian F, Jennings R ve Gardner W. 1987. Antiserum to scrapie ile ilişkili fibril proteini ile çapraz reaksiyona girer. Spiroplasma mirum fibril proteinleri. J. Clin. Microbiol. 25: 2430-2431.
  2. Daza C, Guillen J, King J, Ruiz V. Tanımlanamayan kadavralardan formaldehit içine sabitlenmiş kas dokusundan DNA ekstraksiyonu ve saflaştırma yönteminin değerlendirilmesi.  Med Dergisi, 2014; 22 (1): 42-49,
  3. Butler G, Kotani H, Kong L, Frick M, Evancho S, Stanbridge E ve Mcgarrity G. Sınıf Mollicute Üyelerinde Proteinaz K Dayanıklı Proteinlerin Belirlenmesi ve Karakterizasyonu. Enfeksiyon ve Bağışıklık, 1991, 59 (3): 1037-1042
  4. López M, Rivera M, Viettri M, Lares M, Morocoima A, Herrera L, vd. DNA'dan ekstrakte etmek için iki protokolün karşılaştırılması Trypanosoma cruzi aksenik ortamda yetiştirilen. Rev. Peru. Med Exp. Halk Sağlığı  2014; 31 (2): 222-227. Erişim: scielo.org
  5. Jiménez G, Villalobos M, Jiménez E ve Palma W. Moleküler çalışmalar için parafin malzemesinden beş DNA ekstraksiyon protokolünün etkinliğinin belirlenmesi. Rev Méd Univ Kosta Rika. 2007; 1 (1): 10-19.