Bakteriyel smear özellikleri ve hazırlanması



 bakteriyel yayma Optik bir mikroskop altında gözlem için, şeffaf bir cam plaka veya slaytlar üzerinde gerçekleştirilen bir bakteri mikroorganizma süspansiyonunun ince bir filmi şeklinde bir uzatmadır..

Mikroorganizmaları mümkün olduğu kadar ayırmak için film biçiminde uzatma yapılır, çünkü gruplanırlarsa gözlem net değildir..

Bakteriyel kültürlerin incelenmesinde, smear hazırlama teknikleri, fiksasyon ve renklendirme, onları daha iyi analiz etmek için kullanılır. Mikroorganizmaların küçük boyutlarından dolayı, gözlem için mutlaka optik bir mikroskop kullanılması gerekir.

Optik mikroskoplar, lekelerin gözlenmesi için vazgeçilmez araçlardır. Bunlar, optik lens ve ışık kullanır; örneklerin boyutlarının büyük oranda artmasını sağlar..

Genel olarak, canlı hücrelerin çoğu renkli olan, optik mikroskobu ile görülen, renksiz, şeffaf numuneler oldukları ve çok az iç kontrast ve çevreleri ile çok az kontrast sergileyen yapıları yoktur..

Basit ışık alanı mikroskobu ile gözlem, yardımcı boyama teknikleri kullanılmadan çok sınırlıdır ve mikroorganizmaların hareketinin gözlemlenmesinde olduğu gibi sadece bazı durumlarda kullanılır..

Mikroorganizmaları en iyi şekilde gözlemlemek için, kontrast ve çözünürlük arasında bir denge sağlanmalıdır. Hücrelerin detayları, yüksek çözünürlükte bile mikroskop altında gözlenemez; Boyaların kullanımı, gözlem için kontrast sağlayan boyama teknikleriyle istenmektedir..

indeks

  • 1 Kaliteli bir bakteriyel bulaşmanın özellikleri
    • 1.1 Mükemmel kontrast
    • 1.2 İyi düzeltme
    • 1.3 İyi boyama
  • 2 Hazırlık
    • 2.1 A. Frotis
    • 2.2 B. Fiksasyon
    • 2.3 C. Basit boyama
    • 2.4 D. Smearın kesin korunması
  • 3 Kaynakça

Kaliteli bir bakteriyel bulaşmanın özellikleri

Mükemmel kontrast

Mükemmel bir kontrast elde etmek için, denilen karmaşık mikroskoplar vardır. faz kontrast mikroskobu, diferansiyel girişim ve karanlık alan mikroskobu. Bu mikroskop türü, kılıflar ve filamentler gibi bakteriyel yapıları gözlemlemek için kullanılır..

Boyama, net bir alan mikroskobu ile elde edilen kontrastı arttırmak için basit bir tekniktir. Bu teknikte, mikroskopta gözlemi gözle görülür şekilde iyileştiren farklı boyalar kullanılabilir.

Lekeler doğrudan slaytlar üzerindeki mikroorganizma süspansiyonlarının lekeleri veya uzantıları üzerinde yapılır, önceden kurutulur ve sabitlenir.

İyi düzeltme

Fiksasyon hücresel yapıları korumak için kullanılan bir tekniktir; mikroorganizmaların etkisizleşmesine ve lamın camına yapışmasına neden olur. Farklı fiksasyon uygulamaları vardır: ısı fiksasyonu ve kimyasal fiksasyon.

Isı fiksasyonu

Bakteriyel smear gözleminde en çok kullanılan yöntem budur. Teknik, smear'in bakteriyel süspansiyonunun bir çakmağın alevinden geçirilmesinden ibarettir. Bu teknik, bakterilerin dış morfolojisini koruyabilir, ancak iç yapılarını tahrip edebilir.

Kimyasal fiksasyon

Kimyasal fiksasyon, diğerlerinin yanı sıra formaldehit veya formaldehit, etanol ve asetik asit gibi korunmada kimyasalları kullanır. Kimyasal sabitleme maddelerinin kullanılmasının avantajı, mikroorganizmaların iç hücre yapılarının korunmasının sağlanmasıdır..

İyi boyama

Önceden kurutulmuş ve sabit bir lekenin boyanması için en yaygın prosedürler pozitif veya basit boyama, diferansiyel boyama ve negatif boyamadır. Belirli hücre yapılarını (kapsül, spor, flagella) boyama için özel teknikler de vardır..

Pozitif boyama veya basit boyama

Pozitif veya basit boyama, en çok kullanılan leke bulaşma tekniğidir. Mikroskop altında gözlemlenmelerine izin vererek bazı mikrobiyal yapılara bağlanma yeteneğine sahip boyaları kullanır..

Bu boyalar, kimyasal yapılarında, alternatif çift bağlar ve basit bağlarla (konjugasyon) kromoforik gruplara (renkli kısım) sahiptir. Bu bağlar, bazı hücresel yapılara sahip iyonik veya kovalent bağlar oluşturabilir..

Pozitif veya basit boyamada kullanılan boyalar çoğunlukla kimyasalların kimyasal türevleridir. anilin (renkli organik tuzlar).

Öte yandan, boyalar arasında bazılarını baz pH, bazılarını asit pH ile bulabiliriz..

Temel renklendiriciler

Bazik boyalarda, kromofor grubu pozitif bir elektrik yüküne sahiptir. Prokaryotik mikroorganizmaların büyük çoğunluğu nötr bir iç pH'a sahiptir ve hücre yüzeyleri negatif olarak yüklenir. Bu elektrostatik etkileşim sayesinde, kromofor hücreye bağlanır ve onu boyar.

Bazik boya örnekleri, diğerleri arasında metilen mavisi, menekşe kristali, malakit yeşili, bazik fuscin, safranindir..

Asit boyaları

Asit boyalarında kromofor grubunun negatif bir elektrik yükü vardır. Bunlar, pozitif yüklü amino gruplarına sahip proteinlerin boyanması için kullanılır. Asit boya örnekleri asit fuscin, gül Bengal, Kongo kırmızısı ve eozindir..

Diferansiyel boyama

Diferansiyel boyama tekniği, mikroskopta farklı mikroorganizmaları ayırt etmek için farklı renk veya yoğunlukta iki boya uygulamaktan oluşur. Gram boyama ve asit-alkol direnç boyama, bakteriyolojide en çok kullanılan diferansiyel lekelerdir.

Gram boya, hücre duvarının tipine ek olarak şekli, boyutu, hücre gruplamasını bilmek için ön bir test olarak kullanılır. Gram boyama testi ile hücre çeperli bakteriler Gram pozitif bakteriler ve Gram negatif bakteriler olarak sınıflandırılır..

Olumsuz boyama

Bu teknikte, hücresel iç bölgeye nüfuz etmeyen kimyasal boyalar kullanılır, ancak mikroorganizmaların siyah bir arka plan gibi göründüğü ortamı yaparlar..

Negatif boyama tekniğinde, smear, bir damla Çin mürekkebi veya nigrosin süspansiyonu ile yapılır, oda sıcaklığında kurumaya bırakıldıktan sonra ışığın geçişine opak bir film oluşturur. Bu şekilde, mikroorganizmalar koyu arka plan üzerinde parlak formlar olarak gözlenir.

hazırlık

A. Smear

1.- Slaytları çok iyi yıkayın, emici kağıtla kurulayın ve etiketleyin. Etiket, işleyen kişinin hazırlığının, tarihinin ve adının içeriğini belirtmelidir..

2.- Çakmağı yakınız ve inokülasyon döngüsünü alevde kırmızı sıcak olana kadar sterilize ediniz..

3.- Kolu soğumaya bırakın.

4.- Bakteriyel kültürün tüpünü alın, kapağı çıkarın ve tüpün ağzını çakmağın alevi yanına (alev) yaklaştırın.

5.- Bakteri kültürünü içeren tüpün içine inokülasyon döngüsünü yerleştirin ve örneği alın.

6.- Kültür sıvı bir ortamdaysa, kulp ile alınan numuneyi lamın ortasına yerleştirin ve yaklaşık 2 cm çapında bir daireye dikkatlice yayın.

7.- Aşılama döngüsünü tekrar sterilize edin.

8.- Smearın havada kurumasını sağlayın.

9.- 3 ile 8 arasındaki adımları üç kez tekrarlayın.

10.- Eğer kültür katı bir ortam içindeyse, slayt üzerine önceden bir damla damıtılmış su konmalıdır. Bu, 2 ila 5 arasındaki adımların göstergelerine göre (asepsinin koşulları) inokülasyon sapı ile alınan kültürün küçük bir örneğini karıştırmak için yapılır..

11.- Seyreltilmiş numuneyi slayttaki su damlası ile uzatın ve üç kez tekrarlayın.

B. Fiksasyon

1.- Sıvı ortamda kültürden üretilen kuru lekelere, iki damla metanol veya mutlak etanol eklenir.

2.- Havada kurumadan çakmaktan kurumaya bırakın.

3.- Eğer smear katı ortamdaki bir kültürden gelirse, kuru smear ısıyla sabitlenir, çakmağın alevinin en sıcak alanından hızla 2-3 kez geçer..

4.- Smearın alt kısmına sol elin dorsal kısmı ile dokunun (sağ el için, aksi halde sağ el kullanın) ve soğuk olup olmadığını kontrol edin..

C. Basit boyama

1.- Smear’a seçilen boyadan 2 damla ekleyin ve her boyanın spesifik protokollerinde (genellikle 1 ila 5 dakika arasında) istenen süre boyunca etki etmesini sağlayın..

2.- Bazı boyalar aktivasyonları için ısının kullanılmasını gerektirir; bu durumda lambanın alevi içindeki lamı ısıtırken çok dikkatli olunması gerekir (cımbızla değiştirin ve kaynatmayı önleyin). Yaymanın aşırı ısınması, gözlemlemek istediğiniz hücreleri tahrip edebilir.

3.- Bir boyadan damıtılmış suyla yıkayarak fazla boyayı çıkarın. Çalışma masasına yatırılmış slaytı hafifçe vurarak yıkama suyunu çıkarın.

4.- Hava kurumasını bekleyin.

5.- Gözlem türüne bağlı olarak, bu aşamada bir lamel kullanılır. Lamel lekeyi korur ve korur. Bu aşamada yağa batırılarak bir gözlem yapılırsa, lamel kullanılmaz, ancak leke korunamaz.

D. Smear'in kesin korunması

1.- Smear'ı aşağıda belirtilen çözeltilerin her birine, en az 5 dakika boyunca arka arkaya daldırın. Bu "banyoların" amacı, smear'i tamamen susuz bırakmaktır. Lekeleri bir sonraki banyoya koymadan önce her reaktif boşaltılmalıdır..

Susuzlaştırma banyolarının sırası aşağıdaki gibidir:

  1. Etanol% 70
  2. % 95 Etanol
  3. Saf aseton
  4. Aseton-ksilol 1: 1 karıştırın
  5. ksilen

Ardından havayla kurumaya bırakın.

2.- Lamel, tercihen 22 × 22 mm, Kanada balzamı veya diğer montaj araçlarını kullanarak monte edin.

referanslar

  1. Briggs, G. (1965). Mikrobiyolojik Laboratuvar Kazaları ve Enfeksiyonlarında Nedensel Faktörler. ABD Ordusu Biyolojik Laboratuvarları. Fort Detrick.
  2. Cappucino, J.G. ve Welch, C.T. (2017). Mikrobiyoloji: Bir Laboratuvar El Kitabı. Pearson.
  3. Holt, J.G. Editör. (1977). Bergey'nin Belirleyici Bakteriyoloji El Kitabı. 8inci Baltimore: Williams ve Wilkins Şirketi.
  4. Johnson, T.R. ve Dava; C.l. (2018). Mikrobiyolojide Laboratuvar Deneyleri. Pearson.
  5. Tille, P. (2017). Teşhis Mikrobiyolojisi. 14inci St. Louis, ABD: Elsiever, Inc.