Kısıtlama enzimleri fonksiyonları, etki mekanizması, çeşitleri ve örnekleri



kısıtlama enzimleri belirli archaea ve bakteriler tarafından, içindeki virüslerin yayılmasını engellemek veya "sınırlamak" için kullanılan endonükleazlardır. Özellikle bakterilerde yaygındır ve kısıtlama / modifikasyon sistemi olarak bilinen yabancı DNA'ya karşı savunma sistemlerinin bir parçasıdır.

Bu enzimler, çift sarmallı DNA'nın belirli bölgelerde, tekrarlanabilir şekilde ve ek enerji kullanılmadan kesilmesini katalize eder. Birçoğu ayrıca ATP veya S-adenosil metionin gerektirse de, çoğu magnezyum veya diğer iki değerli katyonlar gibi kofaktörlerin varlığını gerektirir..

Kısıtlama endonükleazları, 1978'de keşiflerinden dolayı Nobel Tıp Ödülü'nü alan Daniel Nathans, Arber Werner ve Hamilton Smith tarafından keşfedildi. Adı genellikle ilk defa gözlemlendikleri organizmadan türetilir..

Bu tür enzimler, DNA klonlama yöntemlerinin ve diğer moleküler biyoloji ve genetik mühendislik stratejilerinin geliştirilmesinde yaygın olarak kullanılır. Belirli dizilerin tanınması ve tanıma alanlarına yakın dizileri kesebilme özelliği, onları genetik deneylerde güçlü araçlar yapar.

Belirli bir DNA molekülüne etki etmiş olan kısıtlama enzimleri tarafından üretilen fragmanlar, enzimin DNA'yı kestiği yerler hakkında bilgi kullanarak orijinal molekülün bir "haritasını" oluşturmak için kullanılabilir..

Bazı kısıtlama enzimleri, DNA'da aynı tanıma yerine sahip olabilir, ancak mutlaka aynı şekilde kesmeleri gerekmez. Bu nedenle, künt uçları kesen kesikler yapan enzimler ve moleküler biyolojide farklı uygulamaları olan çıkıntılı yapışkan uçları kesen enzimler vardır..

Şu anda, farklı ticari evler tarafından sunulan yüzlerce farklı ticari kısıtlama enzimi vardır; bu enzimler farklı amaçlar için "özel" moleküler makaslar gibi çalışırlar..

indeks

  • 1 İşlevler
  • 2 Etki mekanizması
  • 3 Türleri
    • 3.1 Tip I kısıtlama enzimleri
    • 3.2 Tip II kısıtlama enzimleri
    • 3.3 Tip III kısıtlama enzimleri
    • 3.4 Tip IV kısıtlama enzimleri
    • 3.5 Tip V kısıtlama enzimleri
  • 4 Örnek
  • 5 Kaynakça

fonksiyonlar

Kısıtlama enzimleri, bir nükleotid zincirindeki bitişik nükleotitler arasındaki fosfodiester bağı içindeki ester bağını hidrolize ettiği veya parçaladığı için polimerazların zıt işlevine hizmet eder..

Moleküler biyoloji ve genetik mühendisliğinde, ekspresyon ve klonlama vektörlerinin yapımında ve ayrıca spesifik sekansların tanımlanmasında yaygın olarak kullanılırlar. Bunlar ayrıca rekombinant genomların yapımı için faydalıdır ve büyük biyoteknolojik potansiyele sahiptir.

Gen terapisindeki son gelişmeler, bazı genlerin canlı hücrelere taşınması için bir araç olan ve muhtemelen hücre genomunun içine sokma kabiliyetine sahip olan vektörlere belirli genlerin sokulması için mevcut kısıtlama enzimlerini kullanmaktadır. kalıcı değişiklikler.

Etki mekanizması

Kısıtlama enzimleri, çift sarmallı DNA sekanslarını ve hatta RNA'yı tanıyabilmesine rağmen, çift sarmallı DNA'nın kesilmesini katalize edebilir. Kesim, dizilerin tanınmasından sonra gerçekleşir..

Etki mekanizması, fosfodiester bağının bir fosfat grubu ile bir DNA zincirinin omurgasında bir deoksiriboz arasındaki hidrolizinden oluşur. Enzimlerin çoğu tanıdıkları yerde kesebilir, bazıları ise ondan önce veya sonra 5 ila 9 çift baz keser..

Normalde bu enzimler fosfat grubunun 5 'ucunda kesilir, 5' fosforil ucu ve bir terminal 3 'hidroksil ucu ile DNA parçalarına yol açar..

Proteinler, DNA'daki tanıma bölgesiyle doğrudan temas etmediğinden, belirli bir bölgeye ulaşana kadar, belki de DNA şeridi üzerindeki "kayma" mekanizmalarıyla art arda yer değiştirmeleri gerekir..

Enzimatik kesim sırasında, DNA iplikçiklerinin her birinin fosfodiester bağı, kısıtlama enzimlerinin aktif alanlarından birinde konumlandırılır. Enzim tanıma ve kesme bölgesini terk ettiğinde, bunu spesifik olmayan geçici ilişkilerle yapar..

tip

Halen beş tip kısıtlama enzimi bilinmektedir. Aşağıda, her birinin kısa bir açıklaması:

Tip I kısıtlama enzimleri

Bu enzimler, DNA'daki dizilerin tanınması için üç alt birime, bir kısıtlamaya, bir metilasyona ve bir başkasına sahip olan büyük pentamerik proteinlerdir. Bu endonükleazlar, kısıtlama ve modifikasyon reaksiyonlarını katalize edebilen çok işlevli proteinlerdir, ATPase aktivitesine ve ayrıca DNA topoizomerazına sahiptirler..

Bu tip enzimler keşfedilen ilk endonükleazlardı, 1960'larda ilk kez saflaştırıldılar ve o zamandan beri çok derinlemesine çalıştılar.

Tip I enzimler, biyoteknolojik bir araç olarak yaygın şekilde kullanılmaz, çünkü kesim yeri tanıma alanından 1.000 baz çiftine kadar değişen bir mesafede olabilir, bu da onları deneysel tekrarlanabilirlik açısından güvenilmez kılar..

Tip II kısıtlama enzimleri

Boyları 4 ila 8 bp arasında tanımlanan bölgelerde DNA'yı kesen homodimerler veya tetramerlerden oluşan enzimlerdir. Bu kesim yerleri tipik olarak palindromiktir, yani her iki yönde de aynı şekilde okunan dizileri tanırlar..

Bakterilerdeki tip II kısıtlama enzimlerinin çoğu, yabancı karakterlerini tanıdıklarında DNA'yı keser, çünkü kendi DNA'sında olması gereken tipik modifikasyonlara sahip değillerdir..

Bunlar, DNA sekanslarını tanımak ve kesmek için magnezyum (Mg +) dışında bir kofaktör gerektirmediklerinden, en basit kısıtlama enzimleridir..

Tip II kısıtlama enzimlerinin, DNA'daki kesin dizilerdeki basit dizilerin tanınması ve kesilmesindeki doğruluğu, onları moleküler biyolojinin çoğu dalında en çok kullanılan ve vazgeçilmezlerinden biri yapar.

Tip II grup sınırlama enzimleri içinde, her biri için benzersiz olan belirli özelliklere göre sınıflandırılmış çok sayıda alt sınıf vardır. Bu enzimlerin sınıflandırılması, enzimin adını takip eden A'dan Z'ye alfabenin harfleri eklenerek yapılır..

Yararları ile en çok bilinen alt sınıflardan bazıları şunlardır:

Alt Sınıf IIA

Onlar farklı alt birimlerin dimerleridir. Asimetrik dizileri tanırlar ve kesme enzimlerinin üretimi için ideal öncüler olarak kullanılırlar..

Alt Sınıf IIB

Bunlar bir tane daha dimerden oluşuyor ve DNA'yı tanıma dizisinin her iki yanında kesiyorlar. DNA'nın her iki telini de tanıma alanının ötesinde bir baz çift aralığında keserler..

IIC alt sınıfı

Bu tipteki enzimler, DNA iplikçiklerinin bölünmesi ve modifikasyonu işlevlerine sahip polipeptitlerdir. Bu enzimler her iki şeridi asimetrik olarak keser.

IIE alt sınıfı

Bu alt sınıfın enzimleri genetik mühendisliğinde en çok kullanılanlardır. Katalitik bir bölgeleri vardır ve genellikle allosterik bir efektör gerektirirler. Bu enzimlerin etkili bir kesim yapabilmek için tanıma dizilerinin iki kopyası ile etkileşime girmeleri gerekir. Bu alt sınıf içerisinde EcoRII ve EcoRI enzimleri bulunmaktadır..

Tip III kısıtlama enzimleri

Tip III kısıtlama endonükleazları, biri DNA tanıma ve modifikasyonundan, diğeri ise sekansın kesilmesinden sorumlu olan iki alt birimden oluşur..

Bu enzimler, işlevleri için iki kofaktör gerektirir: ATP ve magnezyum. Bu tip kısıtlayıcı enzimler iki asimetrik tanıma alanına sahiptir, DNA'yı ATP'ye bağımlı bir şekilde translokat eder ve tanıma bölgesine bitişik 20 ila 30 bp arasında kesin..

Tip IV kısıtlama enzimleri

Tip IV enzimlerinin, DNA'yı metilasyon etiketleriyle kestikleri için tanımlamaları kolaydır, DNA dizisini tanıma ve kesmekten sorumlu birkaç farklı alt birimden oluşurlar. Bu enzimler kofaktörler GTP ve iki değerli magnezyum olarak kullanılır..

Kesim için özel alanlar, nükleik asitlerin bir veya her ikisinde de metillenmiş veya hidroksimetillenmiş sitozin kalıntıları içeren nükleotit zincirlerini içerir..

Tip V kısıtlama enzimleri

Bu sınıflandırma istilacı organizmalardan spesifik DNA sekanslarını tanımlayan ve kesen CRISPER-Cas tipi enzimleri gruplandırır. Cas enzimleri istilacı organizmaları tanımak ve bunlara saldırmak için bir CRISPER sentezlenmiş kılavuz RNA kullanır.

Tip V olarak sınıflandırılan enzimler, tip I, II ve II enzimleri tarafından yapılandırılmış polipeptitlerdir. Herhangi bir organizmanın DNA'sının bölümlerini ve çok çeşitli uzunluklarda kesebilirler. Esneklikleri ve kullanım kolaylığı, bu enzimleri günümüzde II tipi enzimlerle birlikte genetik mühendisliğinde en sık kullanılan araçlardan biri yapar.

Örnekler

Kısıtlama enzimleri, DNA polimorfizmlerinin tespitinde, özellikle populasyon genetiği ve mitokondriyal DNA kullanılarak yapılan evrimsel çalışmalarda, nükleotid sübstitüsyonları oranları hakkında bilgi edinmek için kullanılmıştır..

Günümüzde bakterilerin farklı amaçlarla transformasyonu için kullanılan vektörler, çoklu kısıtlama enzimleri için tanıma alanlarının bulunduğu çok klonlu bölgelere sahiptir..

Bu enzimler arasında en popüler olanları ilk kez elde edilen ve tarif edilen EcoRI, II, III, IV ve V'dir. E. coli; HindIII H. influenzae ve BamHI B. amiloliquefaciens.

referanslar

  1. Bickle, T. A. ve Kruger, D. H. (1993). DNA Kısıtlamasının Biyolojisi. Mikrobiyolojik İncelemeler, 57(2), 434-450.
  2. Boyaval, P., Moineau, S., Romero, D.A., ve Horvath, P. (2007). CRISPR Prokaryotlarda virüslere karşı kazanılmış direnç sağlar. bilim, 315(Mart), 1709-1713.
  3. Goodsell, D. (2002). Moleküler bakış açısı: Kısıtlama Endonüktürleri. Kök Hücreler Kanser Tıbbının Temelleri, 20, 190-191.
  4. Halford, S.E. (2001). Kısıtlama enzimleri ile atlama, atlama ve ilmek. Biyokimyasal Toplum İşlemleri, 29, 363-373.
  5. Jeltsch, A. (2003). Türlerin kimliğinin korunması ve bakteri türlerinin kontrol edilmesi: kısıtlama / değiştirme sistemleri için yeni bir işlev? gen, 317, 13-16.
  6. Krebs, J., Goldstein, E. ve Kilpatrick, S. (2018). Lewin Genleri XII (12 basım). Burlington, Massachusetts: Jones ve Bartlett Öğreniyor.
  7. Li, Y., Pan, S., Zhang, Y., Ren, M., Feng, M., Peng, N., ... O, S. (2015). Genom düzenleme için Tip I ve Tip III CRISPR-Cas sistemlerinin kullanılması. Nükleik Asitler Araştırması, 1-12.
  8. Loenen, W.A.M., Dryden, D.T.F., Raleigh, E.A., ve Wilson, G.G. (2013). Tip I kısıtlama enzimleri ve yakınları. Nükleik Asitler Araştırması, 1-25.
  9.  Nathans, D., ve Smith, H. O. (1975). DNA moleküllerinin analizinde ve yeniden yapılandırılmasında kısıtlama. Annu. Rev. Biochem., 273-293.
  10.  Nei, M., ve Tajima, F. (1981). Kısıtlama endonükleazlarıyla saptanabilen DNA polimorfizmi. genetik, 145-163.
  11.  Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V., ve Wende, W. (2005). Hücresel ve Moleküler Yaşam Bilimleri Tip II kısıtlaması endonükleazlar: yapı ve mekanizma. CMLS Hücresel ve Moleküler Yaşam Bilimleri, 62, 685-707.
  12.  Roberts, R. (2005). Kısıtlama enzimleri moleküler biyolojinin işgücü haline nasıl geldi. PNAS, 102(17), 5905-5908.
  13.  Roberts, R.J., ve Murray, K. (1976). Kısıtlama endonükleazları. Biyokimyada Eleştirel İnceleme, (Kasım), 123-164.
  14.  Stoddard, B.L. (2005). Homing endonuclease yapısı ve işlevi. Üç Aylık Biyofizik Yorumları, 1-47.
  15.  Tock, M.R. & Dryden, D.T.F. (2005). Kısıtlama ve kısıtlama karşıtı biyoloji. Mikrobiyolojide Güncel Görüşler, 8, 466-472. https://doi.org/10.1016/j.mib.2005.06.003
  16.  Wilson, G. G. ve Murray, N. E. (1991). Kısıtlama ve Değiştirme Sistemleri. Annu. Rev. Genet., 25, 585-627.
  17.  Wu, Z., & Mou, K. (2016). Campylobacter jejuni virülansı ve popülasyon genetiği üzerine genomik bakış. Bulaştırmak. Dis. Çeviri. Med., 2(3), 109-119.
  18.  Yuan, R. (1981). Çok Fonksiyonlu Kısıtlama Endonüktürlerinin Yapısı ve Mekanizması. Annu. Rev. Biochem., 50, 285-315.